來(lai) 源：石洪洋，董 慧(hui)，劉 嘉，崔(cui)笑天，郭 毅，洪 蘭．人參皂(zao)苷Rg1對心肌細胞(bao)氧(yang)化應激損傷的抑制(zhi)作(zuo)用 [J]. 中草藥(yao), 2023, 54(24): 8117-8126.

人(ren)參為五加科植物人(ren)參Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根莖，具有提高免(mian)疫力(li)[1]、改善心(xin)血管功(gong)能[2]、緩解疲勞和抗(kang)(kang)氧(yang)化[3]等(deng)多種功(gong)效。人(ren)(ren)參皂苷Rg1是人(ren)(ren)參主要活性(xing)成分之一，具有顯著的抗(kang)(kang)氧(yang)化、抗(kang)(kang)腫瘤等(deng)作(zuo)用[4-6]。氧(yang)化應(ying)激是急性(xing)心(xin)肌(ji)梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fa)生(sheng)心(xin)室重(zhong)構(gou)的關鍵因(yin)素，最終導致(zhi)線粒體功(gong)能損(sun)傷和細胞凋亡[7]。但人(ren)(ren)參皂苷Rg1對H2O2誘導心(xin)肌(ji)細胞的氧(yang)化應(ying)激是否起保護作(zuo)用尚(shang)不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是(shi)由20～25個核苷(gan)酸組(zu)成的(de)(de)非編碼(ma)RNA，具有調節(jie)基因(yin)表(biao)達等(deng)功能(neng)。研究發(fa)現，人參皂苷(gan)通(tong)過(guo)調節(jie)miRNA的(de)(de)表(biao)達發(fa)揮抗氧化(hua)應激的(de)(de)作用(yong)，miR-499是(shi)一類與抑制(zhi)氧化(hua)應激損傷有關的(de)(de)RNA[8]，已被證明在心(xin)血管疾病的(de)(de)發(fa)病和(he)進展中發(fa)揮作用(yong)[9]，包(bao)括心(xin)肌肥大[10]、缺(que)血性(xing)心(xin)臟(zang)病[11]等(deng)。

miR-499已(yi)被確定為(wei)(wei)AMI和(he)心(xin)(xin)(xin)力衰竭的(de)潛(qian)在(zai)生物標(biao)志物[12-13]。miR-499c是(shi)(shi)和(he)miR-499同源的(de)一種(zhong)特殊RNA，由德克薩斯A&M大學發現，可以將(jiang)多種(zhong)干(gan)細胞(bao)誘導轉化(hua)(hua)為(wei)(wei)心(xin)(xin)(xin)肌(ji)細胞(bao)[14]，但(dan)miR-499c是(shi)(shi)否具有對心(xin)(xin)(xin)肌(ji)細胞(bao)的(de)保護作用尚不(bu)清楚(chu)，并且其是(shi)(shi)否參與(yu)人(ren)參皂苷(gan)Rg1的(de)抗(kang)氧化(hua)(hua)機(ji)制(zhi)(zhi)(zhi)更(geng)不(bu)甚(shen)清楚(chu)。故本(ben)研究(jiu)旨在(zai)探(tan)究(jiu)人(ren)參皂苷(gan)Rg1對心(xin)(xin)(xin)肌(ji)細胞(bao)氧化(hua)(hua)應激損傷的(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)作用，并通過體外(wai)構(gou)建H9c2細胞(bao)的(de)miR-499c轉染模型，探(tan)討人(ren)參皂苷(gan)Rg1通過miR-499c參與(yu)氧化(hua)(hua)應激的(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)(zhi)作用，以評估其在(zai)心(xin)(xin)(xin)腦血管疾(ji)病治療中的(de)潛(qian)在(zai)價值。

1 H9c2氧化應激模型制備

如圖(tu)1所示，75～1200 μmol/L的H2O2處理(li)H9c2細胞20 min，細胞存(cun)活率(lv)降(jiang)(jiang)低(di)，并呈劑量相關性。600 μmol/L的H2O2處理(li)細胞20 min后，細胞存(cun)活率(lv)顯著降(jiang)(jiang)低(di)至（60.39±2.87）%（P＜0.001）。因此，選用600 μmol/L的H2O2作為(wei)制備氧化(hua)應激模型條(tiao)件。

2 人參皂苷Rg1對H9c2細胞氧化應激損傷的抑制作用

2.1 人參皂苷Rg1對氧化應激模型細胞存活率的影響

如圖2-A所示，不同濃(nong)度的人(ren)參(can)皂苷(gan)Rg1處理H9c2細胞(bao)(bao)24 h后，細胞(bao)(bao)存活(huo)率無(wu)明(ming)顯影響，表明(ming)人(ren)參(can)皂苷(gan)Rg1對H9c2細胞(bao)(bao)無(wu)毒性作用。如圖2-B所示，與對照組比較，模(mo)型組細胞(bao)(bao)存活(huo)率明(ming)顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，人參皂(zao)苷Rg1（40、80 μmol/L）組細(xi)胞存活(huo)率顯(xian)著升高（P＜0.01、0.001），且呈劑量(liang)相關(guan)性(xing)。本團(tuan)隊前期(qi)研(yan)究工作中發現ANP可以(yi)抑制H9c2細胞氧應激化(hua)損傷且具有心(xin)肌(ji)保護(hu)作用(yong)(yong)，因此利用(yong)(yong)ANP作為(wei)陽性(xing)對照發現，ANP對氧化(hua)應激模(mo)型H9c2細胞存活率作用(yong)(yong)與40 μmol/L人參(can)皂苷Rg1的作用(yong)(yong)相近[16]。

2.2 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的H9c2細胞LDH漏出率的影響

如(ru)圖3所示，與對照(zhao)組比(bi)較，模型組細胞(bao)LDH漏(lou)出率顯著升高（P＜0.001）；與(yu)模型(xing)組(zu)比較(jiao)，各給藥組(zu)LDH漏(lou)出(chu)率均明顯降低（P＜0.01、0.001），且呈劑(ji)量(liang)相關(guan)性。

2.3 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的H9c2細胞MDA水平和SOD活性的影響

如(ru)圖4所示，與對照(zhao)組比(bi)較，模型組細胞MDA水(shui)平(ping)顯著升高（P＜0.001），SOD活性顯著降低（P＜0.001）；與模型組比(bi)較，各給藥組MDA水平顯著降低（P＜0.01、0.001），人(ren)參皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）組SOD活性顯著升高（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關性。

2.4 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的H9c2細胞ROS水平的影響

如圖(tu)5所示，與(yu)對(dui)照組比(bi)較，模型組細胞ROS水平顯著(zhu)升高（P＜0.001）；與模型組(zu)比較，人參皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）組(zu)和(he)ANP組(zu)ROS水平顯著(zhu)降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性(xing)。

2.5 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的H9c2細胞線粒體膜電位的影響

氧化應激可以引(yin)起(qi)細胞線粒體膜(mo)電位的(de)改變，導致線粒體損傷，進而引(yin)起(qi)細胞凋亡及(ji)壞死。如圖(tu)6所示，與對照組比較，模型組細胞綠/紅色熒光比值升高（P＜0.001），表明H9c2細胞線粒(li)體膜電位降(jiang)低；與模型組比較，各給(gei)藥組綠/紅色熒光比值顯著降(jiang)低（P＜0.05、0.01、0.001），表(biao)明人參(can)皂苷Rg1和(he)ANP均可(ke)以使H2O2引起的H9c2細胞線粒體(ti)膜電位(wei)恢復。

3 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

如(ru)圖(tu)7所示，與對照組(zu)比較，模型組(zu)cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Bax蛋(dan)白表達水平(ping)均顯(xian)著升高（P＜0.001），Bcl-2蛋白(bai)表達水平顯著(zhu)降低(di)（P＜0.001）；與模型組比較，各給(gei)藥組cleaved Caspase-9和Bax蛋白(bai)表(biao)達水平均(jun)顯(xian)著降低(di)（P＜0.01、0.001），Bcl-2蛋(dan)白(bai)表達(da)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；人參皂苷(gan)Rg1（20、40、80 μmol/L）組cleaved Caspase-3蛋白表(biao)達水平顯(xian)著降(jiang)低（P＜0.01、0.001）。提示人參皂苷Rg1可以減少(shao)H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。

4 人參皂苷Rg1對H9c2細胞miR-499c表達的影響

為探討人參(can)皂苷Rg1對(dui)H9c2細胞抗(kang)氧化(hua)的作(zuo)用機制(zhi)，首先觀(guan)察人參(can)皂苷Rg1對(dui)H9c2細胞內miR-499c表達(da)的影(ying)響。如圖8所示(shi)，與對照組(zu)比較(jiao)，人參皂(zao)苷(gan)Rg1組(zu)miR-499c表達顯著升高(gao)（P＜0.05）。

5 miR-499c在人參皂苷Rg1抑制H2O2誘導H9c2細胞氧化應激損傷中的作用

5.1 miR-499c在人參皂苷Rg1抑制H2O2誘導H9c2細胞氧化應激時對ROS生成的影響

如圖9所示，與模型組(zu)比較，人參皂苷Rg1＋H2O2組(zu)、miR-499c＋H2O2組(zu)細胞(bao)中(zhong)ROS熒光強度顯著降低（P＜0.05、0.01），表(biao)明miR-499c和人參皂(zao)苷(gan)(gan)Rg1均可以(yi)抑制(zhi)ROS的生成。人參皂(zao)苷(gan)(gan)Rg1＋miR-499c＋H2O2組ROS熒(ying)光強度進一步降低(di)，提示miR-499c可能參與(yu)人參皂(zao)苷(gan)(gan)Rg1抑制(zhi)細胞氧化應激損傷。

5.2 miR-499c在人參皂苷Rg1抑制H2O2誘導H9c2細胞MMP降低的影響

如(ru)圖10所示，與(yu)模型組(zu)比較(jiao)，人參皂(zao)苷Rg1＋H2O2組(zu)、miR-499c＋H2O2組(zu)綠(lv)/紅色熒(ying)光比值顯著降低（P＜0.05、0.01），表明人(ren)(ren)(ren)參(can)皂苷Rg1和miR-499c均(jun)可(ke)以使H2O2引起的(de)H9c2細(xi)胞線粒(li)體膜電位恢(hui)復；人(ren)(ren)(ren)參(can)皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2組綠(lv)/紅色熒光比值進一步降低(di)，提示miR-499c可(ke)能參(can)與人(ren)(ren)(ren)參(can)皂苷Rg1抑制細(xi)胞氧化應激損(sun)傷。

討論

在心(xin)血管疾病中，氧(yang)(yang)化(hua)應激(ji)是(shi)(shi)AMI的(de)(de)重要促發因(yin)素之一(yi)。一(yi)些抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)劑(ji)藥(yao)物(wu)(wu)已被證實可以(yi)預防和治(zhi)療(liao)AMI[17]，但(dan)尚未達(da)到滿(man)意的(de)(de)效果(guo)。人參(can)皂苷(gan)Rg1是(shi)(shi)人參(can)中的(de)(de)重要生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)成分，在體內外具有抗(kang)衰老、神經(jing)保護(hu)[18]等(deng)多種(zhong)生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)。本(ben)研究重點探討了人參(can)皂苷(gan)Rg1對H9c2細(xi)胞的(de)(de)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)作用及其機制(zhi)。采(cai)用H2O2誘導心(xin)肌細(xi)胞氧(yang)(yang)化(hua)應激(ji)模(mo)型是(shi)(shi)最(zui)常見的(de)(de)氧(yang)(yang)化(hua)應激(ji)模(mo)型制(zhi)備(bei)方法，本(ben)研究發現，600 μmol/L的(de)(de)H2O2誘導H9c2細(xi)胞20 min，能達(da)到最(zui)佳氧(yang)(yang)化(hua)應激(ji)模(mo)型，與先前的(de)(de)研究結果(guo)一(yi)致[19]。

正常狀(zhuang)態下，機(ji)體內(nei)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)與(yu)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)處于一種動態平(ping)衡，但(dan)在(zai)患(huan)病或(huo)衰老(lao)等(deng)狀(zhuang)態時(shi)會(hui)(hui)出(chu)現因自由基(ji)水平(ping)升高而導(dao)致(zhi)的病理(li)現象[20]。人(ren)(ren)體內(nei)有抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)防御系統，包括內(nei)源(yuan)性(xing)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)劑(ji)SOD。總SOD活(huo)性(xing)可以反映機(ji)體對氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)應(ying)激(ji)(ji)(ji)的抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)能力，研究表明(ming)，氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)應(ying)激(ji)(ji)(ji)會(hui)(hui)引起SOD的活(huo)性(xing)增加，但(dan)當(dang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)應(ying)激(ji)(ji)(ji)過度(du)時(shi)，SOD活(huo)性(xing)會(hui)(hui)下降[21]。當(dang)細(xi)(xi)胞受到(dao)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)應(ying)激(ji)(ji)(ji)時(shi)，引起細(xi)(xi)胞膜損傷的氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)應(ying)激(ji)(ji)(ji)反應(ying)，MDA迅速積累[22]。本(ben)研究發現，人(ren)(ren)參皂苷Rg1增加了H2O2誘導(dao)的H9c2細(xi)(xi)胞中SOD活(huo)性(xing)，同時(shi)減少(shao)MDA水平(ping)。表明(ming)人(ren)(ren)參皂苷Rg1作為外源(yuan)性(xing)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)劑(ji)，通過增加內(nei)源(yuan)性(xing)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)劑(ji)的活(huo)性(xing)起到(dao)抗(kang)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)作用。

ROS是(shi)機體內最常(chang)見的(de)(de)自由(you)基[23]，ROS產生(sheng)過量時(shi)能引起線(xian)(xian)粒(li)體功(gong)能障(zhang)礙，表現為線(xian)(xian)粒(li)體的(de)(de)形態變化(hua)和功(gong)能喪失(shi)(shi)。線(xian)(xian)粒(li)體膜(mo)(mo)電(dian)位的(de)(de)破壞是(shi)線(xian)(xian)粒(li)體功(gong)能障(zhang)礙的(de)(de)主要標志。線(xian)(xian)粒(li)體膜(mo)(mo)電(dian)位的(de)(de)丟失(shi)(shi)導致線(xian)(xian)粒(li)體電(dian)子傳遞(di)鏈缺陷(xian)、代(dai)謝耗氧量減(jian)少，從而抑(yi)制(zhi)細胞脂質(zhi)、蛋白質(zhi)等的(de)(de)正常(chang)功(gong)能[24]。結果顯示，H2O2誘導H9c2細胞ROS的(de)(de)生(sheng)成和線(xian)(xian)粒(li)體膜(mo)(mo)電(dian)位丟失(shi)(shi)，而人參皂苷Rg1降(jiang)低了(le)ROS生(sheng)成，同時(shi)抑(yi)制(zhi)線(xian)(xian)粒(li)體膜(mo)(mo)電(dian)位丟失(shi)(shi)，表明人參皂苷Rg1通過抑(yi)制(zhi)自由(you)基的(de)(de)生(sheng)成和線(xian)(xian)粒(li)體膜(mo)(mo)電(dian)位的(de)(de)丟失(shi)(shi)，從而起到抑(yi)制(zhi)氧化(hua)應(ying)激損傷的(de)(de)作用。

Bcl-2和(he)Bax是(shi)Bcl-2家族蛋(dan)白的典型代表，它們在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡過程中(zhong)發揮重要(yao)的調節作用[25]。當細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內Bax高表達(da)時，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)對(dui)死亡信(xin)號(hao)敏(min)感(gan)，促(cu)進細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡。當Bcl-2高表達(da)時，Bcl-2與(yu)Bax形成(cheng)異(yi)源二聚(ju)體(ti)(ti)，抑制細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡[26]。所(suo)以(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內Bax/Bcl-2的比例對(dui)決定細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡的敏(min)感(gan)性(xing)起到(dao)重要(yao)作用。在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡過程中(zhong)，線粒體(ti)(ti)被(bei)認為是(shi)處于(yu)凋亡調控的中(zhong)心位置。在線粒體(ti)(ti)通(tong)路中(zhong)，如Bax被(bei)激活后發生寡聚(ju)化(hua)，并插(cha)入線粒體(ti)(ti)膜(mo)，引起線粒體(ti)(ti)膜(mo)通(tong)透性(xing)改變，釋放線粒體(ti)(ti)內促(cu)凋亡因子，如細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)色素(su)C（cytochrome C，Cyt C）等。

當Cyt C釋放(fang)(fang)到胞內后(hou)，形成(cheng)凋(diao)(diao)亡(wang)復合(he)體(ti)，凋(diao)(diao)亡(wang)復合(he)體(ti)通過招募并激活Pro-Caspase-9，形成(cheng)Caspase-9全酶(mei)(mei)。Caspase-9全酶(mei)(mei)進一步激活效應(ying)Caspase-3和(he)Caspase-7，啟動(dong)Caspase級聯反應(ying)，切割細胞中α-tubulin、Actin等超過100種的底物，最(zui)終導致(zhi)細胞凋(diao)(diao)亡(wang)[27]。Caspase家(jia)族是(shi)細胞凋(diao)(diao)亡(wang)的重要(yao)執行(xing)者，其主要(yao)功能是(shi)促進凋(diao)(diao)亡(wang)信號(hao)的放(fang)(fang)大和(he)傳遞(di)[28]。

在本(ben)研究中，人參皂(zao)苷(gan)Rg1下調(diao)Bax和(he)上調(diao)Bcl-2表達，呈劑量相關性地降(jiang)低Bax/Bcl-2的比例，同時人參皂(zao)苷(gan)Rg1減少cleaved Caspase-3和(he)cleaved Caspase-9蛋白表達。提(ti)示人參皂(zao)苷(gan)Rg1可(ke)能通過抑制(zhi)Caspases，進(jin)而調(diao)控(kong)Bax與Bcl-2蛋白家族(zu)，從而抑制(zhi)細胞凋(diao)亡。

研究發現(xian)，miRNA可(ke)以調(diao)節多種基本細(xi)(xi)(xi)胞功能(neng)(neng)包括細(xi)(xi)(xi)胞凋(diao)亡(wang)和(he)(he)壞(huai)死，這(zhe)是AMI中的(de)2個關鍵細(xi)(xi)(xi)胞事件(jian)[29-30]。其(qi)中miRNA-499可(ke)以保護心肌(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞免受(shou)AMI誘導的(de)凋(diao)亡(wang)作(zuo)用[31]。其(qi)他研究也證(zheng)實(shi)，miR-499通過(guo)靶向程(cheng)序(xu)性細(xi)(xi)(xi)胞死亡(wang)因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、鈣凋(diao)磷酸酶(mei)和(he)(he)動力蛋白(bai)來保護心肌(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞免受(shou)缺血/再灌注誘導的(de)細(xi)(xi)(xi)胞凋(diao)亡(wang)[32]。血漿miR-499被證(zheng)明通過(guo)靶向PDCD4促進內皮炎癥，PDCD14抑(yi)制下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/腫瘤壞(huai)死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）信號(hao)通路[33]。提示miR-499可(ke)能(neng)(neng)作(zuo)為治(zhi)療AMI血管炎癥的(de)潛在(zai)(zai)靶標[34]。miRNA-499c是在(zai)(zai)前期工作(zuo)中發現(xian)的(de)一種具有將非(fei)心肌(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞誘導為心肌(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞功能(neng)(neng)的(de)miRNA。

本研究發(fa)現預處理(li)人參皂(zao)苷Rg1可以(yi)增加(jia)H9c2細胞(bao)miR-499c的(de)表達。同時轉(zhuan)染miRNA-499c后再(zai)預處理(li)人參皂(zao)苷Rg1后發(fa)現，與單純轉(zhuan)染miR-499c或單純預處理(li)人參皂(zao)苷Rg1相比，ROS顯著降低和(he)線粒體膜(mo)電(dian)位恢復(fu)明顯。提示人參皂(zao)苷Rg1可能(neng)通過miRNA-499c對H2O2誘導(dao)的(de)H9c2細胞(bao)氧化(hua)應激起(qi)抑制作用。

綜(zong)上(shang)，人參(can)(can)皂(zao)苷Rg1通過抑制(zhi)(zhi)H2O2誘導的(de)H9c2細胞ROS的(de)生成(cheng)，從而減(jian)少線粒體(ti)膜電位的(de)丟失和線粒體(ti)氧(yang)化應(ying)激，最終抑制(zhi)(zhi)細胞氧(yang)化應(ying)激和細胞凋亡，此作用可(ke)能與(yu)miRNA-499c有關。本研究為人參(can)(can)有效(xiao)成(cheng)分開發新的(de)心腦血管疾病(bing)藥物提供參(can)(can)考(kao)。